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本文核心數據：酶的定向進化原理;高效構建突變體庫的新方法;體外突變發;體內突變法;高通量定向進化的新方法

——酶的定向進化原理

酶的定向進化，旨在試管中模擬自然進化過程，通過提高基因突變率和設計特殊的篩選、選擇方法，快速獲得擁有特定性能的酶。因此，定向進化又被稱為“代替自然選擇的上帝之手”，為試管中的達爾文主義。酶的定向進化通常包括三個步驟：①通過對蛋白編碼序列進行隨機突變、定點突變或重組構建基因突變體庫;②定向篩選、選擇以獲得具有改進表型的突變體;③以該突變體作為下一輪基因多樣化的起點，進行定向進化的迭代，直到獲得性能最優的突變體。

根據文庫構建原理的不同，蛋白質定向進化可分為隨機進化、半理性進化和理性進化三種策略，其大致思路均為由某一靶基因或一族相關的家族基因起始，通過對編碼基因進行突變或重組，創建分子多樣性文庫;篩選文庫獲得能夠編碼改進性狀的基因，作為下一輪進化的模板;在短時間內完成自然界中需要成千上萬年的進化，從而獲得具有改進功能或全新功能的蛋白質。

——高效構建突變體庫的新方法

高效構建多樣化的基因突變體庫是定向進化的關鍵步驟之一。早期通過化學試劑(如甲磺酸乙酯、亞硝酸等)或射線對基因進行無差別隨機突變的傳統方法，由于突變率低并且極易造成基因組不穩定而逐漸被淘汰。取而代之的是一系列相對可控且有高突變率的體外突變法和體內突變法。

——體外突變法

體外突變法主要包括可以產生隨機突變的易錯PCR(error-prone PCR, epPCR)、DNA改組(DNA shuffling)、可以產生非隨機突變的定點飽和突變(site-saturation mutagenesis, SSM)、序列飽和突變(sequence saturation mutagenesis, SeSaM)、合成文庫(synthetic library generation)等，這些傳統體外突變技術成為單個酶定向進化的有力工具，隨著分子生物學的快速發展，構建體外突變體庫的新方法也不斷涌現。

此外，隨著基因高通量合成技術及DNA測序技術的高速發展，傳統的體外突變法存在的共有缺陷，如密碼子缺乏控制、具有序列偏好性等，在一定程度上被合成文庫法所改善。Twist Bioscience公司與M. Reetz課題組合作，在2018年報道了這種新型的體外突變體庫構建方法，即在硅基芯片上應用大規模平行寡核苷酸合成技術，然后進行有效的基因組裝，每種突變體均采用計算機模擬設計，并在合成前進行篩選，因此消除了不需要的序列偏倚、提前出現的終止密碼子和多余的基序。通過實驗分析，這種通過大規模基因合成構建突變體庫的方法相比于利用傳統的易錯PCR或飽和突變等方法，具有野生型序列更少、突變體分布比例更均勻、文庫多樣性更豐富等突出優勢，有利于下游篩選，目前，該方法已實現商業化應用。

——體內突變法

基因突變體庫的另一大類構建方法是體內突變法，即在胞內誘導特定基因的突變，無需進行基因克隆與轉化，很大程度上縮短了定向進化的實驗周期。例如早期開發的基于單鏈DNA重組的多元自動化基因組工程技術(multiplex automated genome engineering, MAGE)，是針對大腸桿菌基因組上特定基因進行體內誘變的重要策略。近年來，CRISPR-Cas介導的重組技術實現了在原核與真核細胞中對目的基因進行高效的片段插入、刪除和替換，大大提高了原核與真核細胞中重組的效率，因此也發展了一批高效的胞內蛋白質定向進化工具。例如將CRISPR-Cas系統和MAGE整合后，基因重組效率由3%提高到98%，插入/替換效率提高至70%;將CRISPR-Cas9與epPCR偶聯(CasPER)可以向酵母基因組中任意基因的600 bp內引入隨機突變。

注：a—基于CRISPR-CAS9同源重組的突變;b—基于NCAS9和DNA聚合酶I的突變;c—基于NCAS9和堿基編輯器的突變

——高通量定向進化的新方法

創建序列覆蓋率高、多樣性強的突變體庫，能最大程度挖掘不同氨基酸序列與其對應表型之間的關系，理論上能夠提高獲得理想突變體的概率。然而，絕大部分篩選和選擇技術通量低、準確性差，導致難以實現對目標蛋白質序列全面且深入的挖掘。因此，開發更快速、靈敏、準確的高通量篩選技術，是提高定向進化效率的關鍵所在。

——新型高通量篩選技術

在酶分子的定向進化過程中，突變體庫的高質量以及高通量篩選方法的可靠性，通常是決定其成敗的關鍵性因素。根據是否需要篩選標記可以將目前普遍應用的高通量篩選方法分為兩大類，其中需要標記的技術為平板篩選法、展示法和熒光篩選法，不需要標記的技術為質譜法、紅外檢測法和特殊光譜檢測法，以下著重對這些方法的研究進展進行綜述。

——連續定向進化

連續進化旨在無人為干預的情況下完成基因突變、蛋白表達、表型選擇與篩選的迭代實驗。連續定向進化通過縮短每輪的進化時間來增加迭代次數，從而提高獲得目標性狀突變體的概率。由D. Liu課題組開發的噬菌體輔助的連續進化系統(phage-assisted continuous evolution, PACE)是較經典的案例。PACE將目標蛋白編碼序列引入篩選噬菌體DNA載體中(selection phage, SP)，并通過敲除pⅢ蛋白編碼區而阻斷噬菌體侵染力，同時將含有pⅢ的輔助質粒(accessory plasmid, AP)和提高大腸桿菌基因突變率的突變質粒(mutator plasmid, MP)引入大腸桿菌內。通過設計特定的基因回路，將pⅢ的表達與目標蛋白的活性相偶聯，再通過類似“潟湖”的液路控制系統使得含有目標活性突變體的噬菌體迭代富集，從而實現進化與篩選自動循環。由于從噬菌體侵染到再組裝的周期較為短暫，因此PACE系統可以在24 h內完成30輪以上的蛋白質進化，達到其他定向進化手段難以企及的迭代次數。

——計算機輔助的定向進化

近年來隨著人工智能的高速發展，借助同源建模與機器學習對蛋白質結構進行預測的準確性日益增加，不同的算法及軟件被開發以用于蛋白質結構的計算。包括Modeller、Rosetta、AlphaFold 2等在內的多種方法已被廣泛用于蛋白質結構的預測。其中，最廣為人知的計算方法為AlphaFold 2，這種算法是通過生物信息學和物理方法結合的方法進行預測。

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